保持冷静:下一代测序的等温PCR

在bob游戏DNA测序领域，聚合酶链反应(PCR)是一种成熟的工具，通过反复处理被称为a的DNA序列来放大特定的DNA序列反应混合物在不同的温度。尽管如此，还是有其他的DNA序列特异性扩增方法可以做到这一点不需要反应温度变化，因此称为序列特异性等温放大技术。这种方法具有极快而不需要热循环仪的双重优势。最近，遗传系统组的科学家们在生命技术公司。在加州开发了一种划算的原位(字面上，位于原始的、自然的或现有的地方)等温放大法的基础上所谓的模板行走机制-一种创建待扩增基因信息DNA副本的工具——使用一对低熔点(Tm)固体表面均聚物引物和一个低Tm溶液相引物，可在不到30分钟内生成数十亿个单克隆菌种。该方法可以在下一代测序流程芯片的单车道上产生超过10亿个亚微米大小的菌落。研究人员说，他们的方法——旨在下一代测序(NGS)，在这种方法中，高通量技术并行化，从而缩短测序过程——可以简化临床基因组应用，使长期寻求的1000美元基因组成为可能。此外，该团队还展示了另一种选择paired-end使用Interstrand DNA照片交联以共价将原始模板的互补链连接到固体表面的测序方法。

遗传系统首席科学家老开勤讨论了他、马兆春及其同事进行的研究bob游戏。“实现成本效益，高效有两种键原位下一代测序的PCR扩增，”Lao说bob游戏。“首先;引物的序列需要低复杂性，例如同源聚合物。第二，两个表面引物之间的距离必须在引物的长度内。”在这种情况下，老挝音符，长度为2-4纳米。

使用模板行走机制的难点之一是找到具有强链置换活性、高processivity和60°C左右最优活性的聚合酶。“熔点温度均聚物的引物要比反应温度大约60吗?劳指出，“这样可以让有效的引物侵入DNA双链的两端，而不需要完全变性的模板。”

另一个挑战是，通过使用包含脱氧尿苷的正引物和反向引物将片段库转换为缺口库，然后进行尿嘧啶特异性切除试剂处理，最大限度地减少引物与DNA插入物的poly-T或TTG重复区之间的杂化。“我们最初的方案有化学或热变性步骤，”劳解释说。”。后来，我们发现CTT三联体重复序列是更复杂基因组中常见的短串联重复序列之一，溶液引物可以退火和延伸生成更短的模板。为了克服这一点，我们使用试剂处理产生缺口的悬垂聚t引物与表面引物，而基因组序列保持双，以防止溶液引物退火。”研究人员给这个策略起了个绰号沃森克里克保护，老挝Quips。

Lao指出，他们还开发了一种不同于bPCR(桥接或跳跃PCR)的另一种对端测序方法，这种方法使用链间DNA光交联，将原始模板的互补链共价连接到DNA上固体表面。“模板行走有一个固相底漆和一个溶液相底漆，因此当完全只有一端的菌落锚定到固体表面时，”老挝解释。“对于成对读数，另一端需要在反向测序之前连接到固体表面。我们花了很长一段时间在缩写CNVK碱作为快速照相交叉连接试剂之前搜索有效的DNA交联试剂。我们还花了大量时间来找到没有的特定缓冲区组合物;在正向测序期间与CNVK基础反应，同时保护模板免受照片损坏。“

由于单一的洞察力，科学家们解决了这些复杂的挑战 - 即乔治教堂的1999年的玉米纸¹。“这篇论文一直在我的脑海中，”老挝感到抱歉。“挑战是如何固定扩增的模板，同时允许行走股来扩散到附近的菌落形成多克隆菌落。”

科学家们表示，他们的方法可以用于NGS平台，通过注入新鲜的酶混合物，使1000美元的基因组成为可能。“相比之下，”劳指出，“如果我们假设每个循环使用相同数量的酶，bPCR试剂的消耗将是模板行走的17或35倍。此外，bPCR的两个引物都在表面形成两条链，在测序前需要去除其中一条互补链。“相比之下，所有的延伸表面引物都有可测序的模板，因此菌群强度至少是bPCR的两倍，这将允许更长的读取时间，更简单的仪器，更便宜的激光和成像系统。”

“模板行走大大降低了菌落形成试剂的成本超过10-20倍，”老挝持续“是基于BPCR的当前NGS测序试剂总费用的约60％，而测序引物和探针小于40％。从纯粹的技术角度来看，基于货物成本，今天的技术已经实现了1,000美元的基因组测序。“

劳说，展望未来，模板行走也可以用来取代一般的PCR，因此它可以在任何模拟或数字PCR平台上实现。“这也将使电池供电的手持设备能够用于即时诊断应用。”此外，他补充说，模板行走将使NGS像定量PCR (qPCR)一样简单，不需要热循环，将样本到文库到菌落集成在一起——这是目前芯片上实验室技术的主要挑战之一。

就可能从他们的研究中受益的其他研究领域而言，老挝得出结论，模板行走的等温放大性质可以使其能够实现在活的有机体内在完整的，甚至是活的细胞中的放大。

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